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一、細胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染

一、實驗方法

1. 培養(yǎng)293T細胞，待細胞長滿后調(diào)整細胞濃度為1×105cells/ml，接種于24孔培養(yǎng)板，每孔500uL，37℃，5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24h，觀察細胞80%粘連。

 2. 制備轉(zhuǎn)染復(fù)合物

A) 用100μl無血清培養(yǎng)基稀釋3’UTR雙熒光素酶報告基因載體，輕輕混勻；

B) 用100μl無血清培養(yǎng)基稀釋RBP過表達載體，輕輕混勻；

C) Lipofectamine 2000使用前，輕輕混勻，用100μl無血清培養(yǎng)基稀釋2.5μl Lipofectamine 2000，輕輕混勻，室溫孵育5min；

D) 將A、 B、C的液體加在一起，輕輕混勻，室溫孵育20min，轉(zhuǎn)染復(fù)合物形成。

3. 將24孔板中200μl 培養(yǎng)基，再分別加入300uL上述混合液，每孔終體積為500uL。質(zhì)粒濃度均為500ng/孔，每組設(shè)置3個復(fù)孔。

5. 37 ℃，5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)4-6h后，吸掉上清液，加入500uL的*培養(yǎng)基，于培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)48h后備用。

二、雙熒光報告基因檢測

2.1 實驗材料

 雙熒光檢測試劑盒(promega E1910)

脫色搖床(海門市其林貝爾TS200A)，低溫冷凍離心機 (Sigma 3K15)，發(fā)光檢測儀 (Molecular Devices SpectraMax®i3 )。

2.2 實驗方法

具體實驗步驟參見試劑盒說明書

裂解細胞 ：吸盡細胞培養(yǎng)液后， PBS輕柔漂洗兩次，參考下表加入適量的1×PLB裂解液(用去離子水將5×Passive Lysis Buffer母液稀釋成1×PLB，可在4℃保存1個月)，室溫搖床放置15min充分裂解后備用。

注：細胞裂解后可以立即測定，也可以先凍存，待以后再測定。凍存樣品需融解，并達到室溫后再進行測定。

水浴溶解Luciferase Assay Buffer Ⅱ溶液后，加入到1劑量的Luciferase Assay Substrate凍干粉中，充分溶解后分裝成若干小管，儲存在-20℃(≦1個月)或-70℃(≦1年)，使用前水浴解凍，上下顛倒兩次并恢復(fù)至室溫備用

按照每個樣本100uL用量，取適量50×Stop & Glo®Reagent，用Stop & Glo®Buffer稀釋成1×Stop & Glo®Reagent，現(xiàn)配現(xiàn)用。

按儀器操作說明書開啟化學(xué)發(fā)光儀或具有檢測化學(xué)發(fā)光功能的多功能酶標儀，將測定間隔設(shè)為2秒，測定時間設(shè)為10秒。

每個樣品測定時，取樣品20uL，加入100uL LARⅡ試劑，用槍打勻后測定RLU1(relative light unit)。

加入100uL1×Stop & Glo®Reagent，用槍打勻后測定RLU2(relative light unit)。

2.3實驗結(jié)果分析