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ReadyAMP^®PCR直接擴(kuò)增技術(shù)應(yīng)用在細(xì)菌16s rDNA鑒定中的流程

隨著分子學(xué)的發(fā)展，細(xì)菌16S rDNA序列的鑒定逐漸成為細(xì)菌特征的“金標(biāo)準(zhǔn)”。大部分實(shí)驗(yàn)室中正逐步使用該方法替代傳統(tǒng)細(xì)菌培養(yǎng)、生化鑒定等方法。16S rDNA因其序列在物種間的高度多樣性，成為細(xì)菌分類(lèi)研究的“分子鐘”，素有“細(xì)菌化石”之稱。

16S rDNA鑒定意義重大，主要體現(xiàn)在以下幾個(gè)方面：

1、測(cè)序結(jié)果和已知細(xì)菌16S rDNA序列數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比較，可以確定未知細(xì)菌的分類(lèi)和物種關(guān)系。對(duì)臨床微生物和環(huán)境微生物意義重大。

2、通過(guò)比較不同細(xì)菌的16S rDNA序列，可以推測(cè)相互之間的親緣關(guān)系和進(jìn)化關(guān)系，進(jìn)而了解細(xì)菌的進(jìn)化和演化史。

3、通過(guò)環(huán)境樣本中細(xì)菌16S rDNA序列比較，可以分析和總結(jié)出不同細(xì)菌在不同環(huán)境下對(duì)自然界的功能和作用。

4、菌落中16S rDNA可變區(qū)進(jìn)行鑒定，可提供菌落組成、表達(dá)豐度、以及系統(tǒng)進(jìn)化分析。為菌落與環(huán)境、環(huán)境與人類(lèi)的相互作用提供數(shù)據(jù)支持。

但是常規(guī)獲得16S rDNA序列的方法如圖1。實(shí)驗(yàn)室工作人員zui常用的細(xì)菌DNA提取試劑盒，也就是通用的離心柱式提取基因組

圖1 傳統(tǒng)離心柱提取和ReadyAMP®快速16S rDNA細(xì)菌鑒定試劑盒對(duì)比

DNA。作為傳統(tǒng)且經(jīng)典方法，該方法對(duì)長(zhǎng)期從事提取工作的實(shí)驗(yàn)室人員來(lái)說(shuō)存在幾個(gè)難點(diǎn)：

1、提取時(shí)間長(zhǎng)達(dá)40-90分鐘

2、需要使用溶菌酶、蛋白酶K等酶類(lèi)

3、需要使用多種設(shè)備，包括恒溫浴、離心機(jī)等

4、革蘭氏陽(yáng)性菌產(chǎn)量低

針對(duì)以上痛點(diǎn)和難點(diǎn)，我司開(kāi)發(fā)了ReadyAMP^®快速16S rDNA細(xì)菌鑒定試劑盒，操作流程見(jiàn)圖1。該方法最大的特點(diǎn)如下：

1、簡(jiǎn)單便捷、一步完成；

2、檢測(cè)線低至10⁴個(gè)/mL細(xì)菌；

3、檢測(cè)樣本豐富，例如對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期菌液、菌斑、甘油菌等；

4、樣本需求量低，例如菌液/甘油菌1-3μL、菌斑1個(gè)；

5、革蘭氏陰性菌檢出；

6、革蘭氏陽(yáng)性菌99.99%檢出；

7、難培養(yǎng)樣本有效；

8、珍貴樣本有效；

已驗(yàn)證的細(xì)菌包括：

案例A——對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)菌快速擴(kuò)增16S rDNA

以對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期菌液為模板，使用ReadyAMP^®快速16S rDNA細(xì)菌鑒定試劑盒（貨號(hào)Nu-16S01）擴(kuò)增16S rDNA，以菌液對(duì)應(yīng)硅膠柱提取基因組為對(duì)照。

案例B——單菌落快速擴(kuò)增16S rDNA

以對(duì)單菌置生理鹽水中為模板，使用ReadyAMP^®快速16S rDNA細(xì)菌鑒定試劑盒（貨號(hào)Nu-16S01）擴(kuò)增16S rDNA，以菌液對(duì)應(yīng)硅膠柱提取基因組為對(duì)照。